梅山猪、大白猪和梅大杂交猪背最长肌中差异表达的14个表达序列标签的分离、鉴定及组织表达分析

为了揭示猪杂种优势的分子机理,利用mRNA差异显示技术研究梅山猪,大白猪和梅大杂交猪背最长肌中基因表达的差异,分离14条在杂种与纯种背最长肌中差异表达的表达序列标签(EST),并用半定量RT-PCR鉴定.核苷酸序列分析表明,这14个EST与已知的基因或表达序列标签没有明显的同源性,随后这14条EST被提交到GenBank数据库.组织表达谱分析揭示了这些EST在心、脾、肝、肾、小肠、卵巢、肺等绝大多数组织中表达,说明这些基因对生命过程很重要.这些研究结果表明梅山×大白杂交组合的杂种与纯种之间的不同基因差异表达的方向存在巨大差异,猪杂种优势可能是在一定阶段有诸多不同的必不可少的基因向各种方向差异表达共同作用的结果.     

地高辛(DIG)和碱性磷酸酶标记cDNA探针检测PRSV

根据GenBank发表的PRSV(番木瓜环斑病毒)中国Sm株系的外壳蛋白基因序列,设计特异引物,以美中红(Caricapapaya L.cv.Meizhonghong)带病样品的RNA为模板进行RT-PCR扩增,将其目的cDNA片段克隆到pGEM-Teasy质粒载体上。以重组质粒作模板,用PCR-DIG标记方法制备cDNA探针,另一种非放射性探针是经凝胶电泳分离、纯化cDNA片段,用碱性磷酸酶直接进行标记。利用地高辛(DIG)标记和碱性磷酸酶直接标记的cDNA探针核酸分子杂交及RT-PCR方法对PRSV进行了检测。结果表明,(1)测序结果表明美中红No.2序列与中国优势株系Sm的同源性为94.7%;(2)DIG标记的3种cDNA探针(861,455和215bp)对样品的总RNA检测结果一致,且861bp的探针杂交斑点最为清晰,上述核酸杂交结果与RT-PCR检测结果相符,核酸分子杂交检测的灵敏度和特异性能满足常规检测的需要;(3)碱性磷酸酶直接标记861bp的cDNA探针可进行PRSV的斑点杂交检测,可获得有效的杂交结果;(4)DIG标记探针对叶脉进行了印迹杂交检测,结果与RT-PCR检测结果相符。     

小菜蛾类钙粘蛋白cDNA片段的克隆和序列分析

鳞翅目昆虫中肠刷状缘膜囊泡（brush border membrane vesicles，BBMV）有两类能与Cryl毒素结合的受体蛋白，一类是氨基肽酶N（APN），另一类是类钙粘蛋白（cadherin-like protein）。Gahan等（2001）报道了烟芽夜蛾中肠类钙粘蛋白基因失活导致了烟芽夜蛾（Heliothis viresce）对Bt毒素CrylA产生了高抗性，引起了各国科研人员的关注。近年来，先后有多种昆虫类钙粘蛋白基因被克隆和测序（Gahan et al．，2001：Morin et al．，2003）。     

广西巴马小型猪卵泡抑素(Follistatin)cDNA的克隆和序列分析

从广西巴马小型猪的卵巢中提取总RNA，并以其为模板，应用逆转录一聚合酶链式反应(RT—PCR)，在合成的特异性引物引导下，扩增得到巴马小型猪卵泡抑素(Follistatin) cDNA的全序列，长度为1035bp。该扩增片段经纯化后，连接到pMD18-T载体上扩增。经序列分析结果表明，本研究中克隆的猪卵泡抑素cDNA序列与GeneBank中已报道的家猪卵泡抑素同源性高达99．4％，与奶牛、家鼠、挪威鼠和马等其他物种的卵泡抑素cDNA序列间同源性也大于89％。     

禽白血病A亚群病毒引起的淋巴细胞性白血病诊断

采用病理组织学方法和分子生物学技术对某肉种鸡场的感染鸡进行实验室诊断,在肿胀的肝、肾和法氏囊组织切片中观察到成淋巴细胞增生病变。针对禽白血病病毒(ALV)群特异性抗原P27基因进行RT-PCR扩增,肾、肺、肝、脾病料样本中ALV病原核酸的检出率分别为100%、100%、90%和50%。将扩增的目的基因序列与GenBank公布的ALV参考毒株相应序列进行比较,核苷酸序列的同源性达到93.6%~97.7%。取ALV囊膜糖蛋白gp85基因的扩增产物进行酶切分析,扩增的目的片断中存在BglⅡ和SspⅠ酶切位点,BamHⅠ不能切割PCR产物。试验结果证实本次疫病是由ALV-A亚群病毒引起的淋巴细胞性白血病。     

家蚕含RRM保守结构域蛋白基因(Bmrrm)的克隆及序列分析与表达研究

RRM(RNA recognition motif)是RNA结合蛋白中广泛存在的一种保守结构域。从构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选得到一条含有RRM保守结构域的cDNA,命名为Bmrrm(GenBank登录号:DQ534196)。Bmrrm基因全长1086 bp,开放阅读框大小为894 bp,编码297个氨基酸残基,蛋白理论分子质量33.2 kD,等电点9.69,预测的三级结构由2个α螺旋和4个β折叠组成。将该基因的PCR扩增产物于原核表达载体pET-28a(+)中表达后经SDS-PAGE检测,在36 kD处的特异性蛋白条带与预期值相符,重组蛋白以可溶的形式表达。将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA检测效价大于1∶6400。采用荧光定量PCR方法对家蚕卵、5龄幼虫、蛹、蛾4个发育时期以及5龄幼虫各组织中Bmrrm的mRNA转录水平进行检测比较,发现在蛹期和5龄幼虫生殖腺、表皮中的转录水平较高。采用免疫印迹方法在家蚕的卵期、5龄幼虫、蛹期,以及5龄幼虫的生殖腺、表皮、脂肪体中检测到BmRRM蛋白有明显表达,但在蛾期及5龄幼虫的其他组织中未检测到该蛋白。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞化学实验,BmRRM蛋白在整个细胞周期主要分布于细胞核,仅少量分布于细胞质。初步推测BmRRM蛋白参与蚕体内RNA前体的剪接、细胞定位及维持稳定等转录后调控过程。     

A multiplex RT-PCR assay for the rapid and differential diagnosis of classical swine fever and other pestivirus infections

Classical swine fever is a highly contagious viral disease causing severe economic losses in pig production almost worldwide. All pestivirus species can infect pigs, therefore accurate and rapid pestivirus detection and differentiation is of great importance to assure control measures in swine farming. Here we describe the development and evaluation of a novel multiplex, highly sensitive and specific RT-PCR for the simultaneous detection and rapid differentiation between CSFV and other pestivirus infections in swine. The universal and differential detection was based on primers designed to amplify a fragment of the 5′ non-coding genome region for the detection of pestiviruses and a fragment of the NS5B gene for the detection of classical swine fever virus. The assay proved to be specific when different pestivirus strains from swine and ruminants were evaluated. The analytical sensitivity was estimated to be as little as 0.89 TCID₅₀. The assay analysis of 30 tissue homogenate samples from naturally infected and non-CSF infected animals and 40 standard serum samples evaluated as part of two European Inter-laboratory Comparison Tests conducted by the European Community Reference Laboratory, Hanover, Germany proved that the multiplex RT-PCR method provides a rapid, highly sensitive, and cost-effective laboratory diagnosis for classical swine fever and other pestivirus infections in swine.     

新城疫疫苗株与分离毒株的蚀斑克隆与毒力鉴定

2株NDV贵州分离株(GN、ND99)与2株疫苗毒株(Ⅰ系和Ⅱ系)经检测为生物异质性毒株.利用蚀斑克隆技术对以上4株毒株进行蚀斑纯化,结果得到11株克隆毒株.其中,10株克隆毒株在鸡胚成纤维细胞上形成圆形、透明无色蚀斑,1株形成圆形、透明、红色蚀斑.经RT-PCR检测,11株克隆毒株中6株为弱毒,形成蚀斑的大小在0.4～8mm之间;5株为强毒,形成蚀斑的大小在1.0～2.0mm之间.结果表明:所形成蚀斑的大小与病毒毒力具有一定的相关性.     

新型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中已发表的1型鸭病毒性肝炎(duck hepatitis virus type 1,DHV-1)和新型鸭病毒性肝炎(new type duck hepatitis virus,N-DHV)全基因序列,在非同源区域设计一对新型鸭病毒性肝炎特异性引物P1/P2,对鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鹅细小病毒细胞毒、流感病毒等鸭常见病病原进行RT-PCR扩增.结果表明引物特异性良好,引物P1/P2仅能特异性扩增出N-DHV的638bp基因片段;敏感性试验结果表明:N-DHV RNA最低检出量为21 pg.同时对临床样品的检测中发现DHV-1和N-DHV存在混合感染的情况.该方法的建立为鸭病毒性肝炎病毒尤其是新型鸭病毒性肝炎病毒的鉴定及快速诊断提供了可靠的依据.